Il Museo fu inaugurato da Papa Giovanni Paolo II l'8 Dicembre 2001 nella solennità dell'Immacolata Concezione. Disposti in otto sale, sono esposti gli oggetti più preziosi appartenenti alla Basilica (chiamata anche "Betlemme d'Occidente"), secondo i seguenti temi: storia della Basilica, Cristo nel mistero della Natività e della Passione, Maria venerata nella Basilica sotto il titolo di Salus Populi Romani e vari Santi legati in modo particolare alla Basilica: San Carlo Borromeo (che fu arciprete della Basilica dal 1564-1572), San Pio V e Beato Pio IX.

Sono esposti libri ed oggetti liturgici, reliquiari, ostensori e calici. Tra le diverse opere di gran-di maestri si possono ammirare i quadri: Salita al Calvario di Giovanni Bazzi detto il Sodoma, la Madonna con Bambino, Sant'Antonio da Padova e Santa Caterina da Siena di Domenico di Iacopo di Pace, detto il Beccafumi, tre tavolette con la storia dell'Icona Salus Populi Romani, della fabbrica di Baldassare Croce. Sono esposti, inoltre, ricordi e testimonianze del Beato Giovanni Paolo II - autografi e testi di Pierluigi da Palestrina - progetti e opere di Gia Lorenzo Bernini.