Il primo nucleo, una raccolta di sculture antiche, fu costituito da Giulio II (1503-13). L'idea del museo nacque con Clemente XIII (1758-69), che con l'assistenza del Winckelmann fece allestire il Museo Profano. Con Clemente XIV (1769-74) e Pio VI (1775-99) nasce il Museo Pio Clementino e nel 1807-10, sotto Pio VII, viene allestito dal Canova il Museo Chiaramonti. Nel 1822 viene aperto il Braccio Nuovo. Con Gregorio XVI vengono aperti nel 1837 il Museo Gregoriano Etrusco, nel 1839 il Gregoriano Egizio, nel 1844 quello Profano Lateranense (oggi Gregoriano Profano) e successivamente il Pio Cristiano. Nei primi decenni del ‘900 vengono allestiti il Museo Missionario Etnologico ed aperta al pubblico la Pinacoteca. Nel 1973 Paolo VI inaugura il Museo Storico e la Collezione d'Arte Religiosa Moderna.

Museo Pio Clementino - Raccoglie esemplari discultura antica come l'Apollo del Belvedere (130-140 d.C.); il gruppo del Lacoonte (I sec. d.C.); l'Apollo Sauroktonos e la Venere Cnidia, la colossale Testa di Giove. Si segnalano i due sarcofagi in porfido di Costanza e di Sant’Elena, rispettivamente figlia e madre di Costantino.

Museo Chiaramonti - Ospita diverse sculture romane, come la statua di Ganimede, una colossale testa di Atena, un ritratto di Tiberio, un rilievo con le tre Grazie (I sec. d.C.). Nella Galleria Lapidaria sono raccoltenumerose iscrizioni pagane e cristiane e nel Braccio Nuovo statue come l'Amazzone ferita, il Doriforo, l'enorme statua del Nilo, l'Augusto di Prima Porta.

Museo Gregoriano Etrusco - Contiene numerosi reperti provenienti per lo più dagli scavi ottocenteschi effettuati nell'Etruria meridionale, come il corredo della tomba Regolini-Galassi. Esposti anche alcuni sarcofagi e una ricca raccolta di vasi greci, italioti ed etruschi. Da segnalare la stele sepolcrale bilingue di Todi con doppia iscrizione, in latino e in gallico (II sec. a.C.).

Museo Gregoriano Egizio - Ideato da uno dei primi egittologi italiani, padre Ungarelli, raccoglie una serie di statue raffiguranti divinità o personaggi della famiglia reale, come la madre e la sorella di Ramses II, sarcofagi, mummie ed elementi dell'arredo funerario. Ricostruita anche la decorazione statuaria di Villa Adriana a Tivoli.

Museo Gregoriano Profano - Espone sculture greche e romane come tre frammenti del Partenone di Atene, la Testa di Atena (460 a.C.), l'Ara dei Vicomagistri (I sec. d.C.) e due grandi rilievi raffiguranti l'Arrivo di Vespasiano a Roma e la Partenza di Domiziano. Presenti alcuni sarcofagi con soggetti mitologici. Tra le copie bronzee spicca il gruppo di Atena e Marsia.

Museo Pio Cristiano - Raccoglie materiali provenienti dagli scavi nelle catacombe romane, numerosi sarcofagi (III-V sec. d.C.), tra i quali un calco del sarcofago di Giunio Basso e la statua del Buon Pastore (III sec. d.C.).

Museo Missionario Etnologico - Documenta le manifestazioni religiose e i culti degli altri continenti. Di notevole importanza le sculture azteche del XV sec., le sculture indiane di divinità induiste, le maschere rituali dell’Oceania e dell’Africa. 

Collezione d'Arte Religiosa Moderna - Allestita in parte nelle sale dell'Appartamento Borgia, decorato dal Pinturicchio, espone opere di Rosai, Boccioni, Balla, De Chirico, Guttuso, Manzù. 

Gallerie Superiori - La Galleria dei Candelabri raccoglie materiale archeologico di epoca romana, come il gruppo scultoreo di Ganimede e l'Aquila (II sec. d.C.) e la statua di Artemide. La Galleria degli Arazzi espone arazzi di manifattura fiamminga (XVI sec.) er omana (XVII sec.). La Galleria delle Carte Geografiche espone 40 riquadri dedicati al territorio d'Italia eseguiti nel 1580-83.

Museo della Biblioteca Vaticana - Ospita diverse testimonianze di arte sacra: la Sala delle Nozze Aldobrandine, con affreschi di età romana; la Sala dei Papiri, con vetri dorati del periodo paleocristiano; il Salone Sistino, con affreschi di Cesare Nebbia e altri artisti; le Sale Paoline; la Sala Alessandrina e la Galleria Clementina, con bozzetti del Bernini.

Pinacoteca - Conserva opere databili dal XII al XVIII sec., realizzate da Pietro Lorenzetti, Simone Martini, Giotto, Beato Angelico, Masolino da Panicale, Filippo Lippi, Perugino, Pinturicchio, Tiziano, Paolo Veronese, Giulio Romano, Ludovico Carracci, Caravaggio (Deposizione di Cristo), Poussin, G. Reni, Guercino, O. Gentileschi. Esposti anche i modelli in argilla usati dal Bernini per le sculture della Cappella del Sacramento e per la Cattedra di San Pietro e i 10 arazzi realizzati a Bruxelles su disegni di Raffaello.